Pada tahun 2089 di Isle of Skye di lepas pantai Skotlandia, pasangan arkeolog Elizabeth Shaw (Noomi Rapace) dan pacarnya Charlie Holloway (Logan Marshall-Green) menemukan peta bintang di sebuah gua yang mereka rekam di antara sisa-sisa beberapa budaya kuno yang tidak berhubungan. Mereka memaknai ini sebagai ajakan dari cikal bakal umat manusia. Peter Weyland (Guy Pearce), pendiri tua dan CEO Weyland Corporation, mendanai pembuatan kapal penelitian ruang angkasa ilmiah yang disebut USS Prometheus untuk mengikuti peta ke planet jauh LV-223 beberapa tahun cahaya dari Bumi.
Awak kapal melakukan perjalanan dalam keadaan hibernasi dengan kecepatan ringan sementara android David (Michael Fassbender) tetap terjaga di kontrol pilot untuk memantau seluruh perjalanan mereka. Pada tahun 2093, kapal tiba di orbit sekitar LV-223. Setelah terbangun dari hibernasi, kru diberitahu tentang misi mereka untuk menemukan alien kuno, yang disebut "Insinyur" yang mungkin pencipta ras manusia. Mereka juga melihat pesan holografik dari Weyland sendiri, yang memberi tahu mereka tentang pendanaannya untuk misi dan bahwa dia telah meninggal. Weyland juga memberi tahu semua orang bahwa Charlie dan Elizabeth bertanggung jawab atas misi tersebut.
Prometheus memasuki atmosfer planet, menghadapi turbulensi yang menghilang ketika mereka menembus tutupan awan dan dapat melihat permukaan. Prometheus mendarat di dekat situs tak diketahui (menyerupai piramida besar seperti kuil) dan tim termasuk Shaw, Holloway, dan David menjelajahinya, sementara Vickers dan Kapten Janek (Idris Elba) tetap berada di atas kapal dan memantau kemajuan mereka. Direktur misi Meredith Vickers (Charlize Theron) memerintahkan mereka untuk menghindari kontak langsung dan kembali jika alien ditemukan.
Di dalam piramida, mereka menemukan kantong udara untuk bernapas. Di ruang lembap yang dibuka David, mereka menemukan ratusan artefak seperti silinder, patung monolitik kepala humanoid, dan mayat alien raksasa yang dipenggal, dianggap sebagai salah satu Insinyur. Mayat lain kemudian ditemukan dalam struktur tersebut, dan spesies tersebut dianggap telah punah. Mereka melihat rekaman arsip Insinyur holografik yang berlari di koridor bereaksi terhadap keadaan darurat yang sudah lama terjadi (juga perlu diperhatikan: Insinyur alien mengenakan pakaian luar angkasa bio-mekanis yang sama persis dengan yang dikenakan alien mati di pesawat ruang angkasa yang jatuh di film Alien asli, dengan demikian menegaskan hubungan antara mereka sebagai satu dan spesies luar angkasa yang sama).
David diam-diam mengembalikan silinder ke kapal, sementara silinder yang tersisa di ruang mulai bocor cairan gelap, diaktifkan oleh perubahan suhu atau atmosfer saat ruang dibuka. Badai yang mendekat dengan cepat memaksa kru untuk kembali ke Prometheus, meninggalkan anggota kru Milburn (Rafe Spall) dan Fifield (Sean Harris) terdampar di struktur piramida setelah tersesat mencoba menemukan jalan keluar. Shaw bersikeras mereka membawa kepala Engineer kembali ke kapal bersama mereka dan mereka nyaris tidak berhasil kembali hidup-hidup, David menyelamatkan pasangan itu ketika mereka ditolak dari pemuatan.
Di kapal, Shaw dan petugas medis Ford (Kate Dickie) menganalisis kepala Insinyur, melepaskan helm berat dengan bantuan David. Mereka menemukan bahwa DNA-nya identik dengan ras manusia. Menggunakan jarum listrik, mereka menghidupkan kembali kepala untuk sementara waktu. Namun, paparan atmosfer yang dapat bernapas, menyebabkan kepala Insinyur yang terpenggal itu membusuk dengan cepat dan hancur. Kemudian, David menyelidiki silinder dan menemukan beberapa ampul berisi cairan hitam kental.
Awak Prometheus membahas makna hidup, android David mempertanyakan mengapa ia diciptakan oleh manusia dan Shaw mempertanyakan keberadaannya sendiri karena dia tidak subur dan tidak dapat menciptakan kehidupan.
David dengan sengaja menginfeksi Holloway dengan zat yang dia temukan di dalam ampul, menyembunyikannya dalam setetes cairan di jarinya dan mencelupkannya sebentar ke dalam segelas minuman sampanye Holloway untuk merayakan penemuan mereka. Kemudian, Shaw dan Holloway yang terinfeksi melakukan hubungan seks. Holloway kemudian melihat ke cermin dan melihat matanya berubah; dia panik dan dia melihat organisme kecil seperti cacing perak muncul dari salah satu kornea matanya.
Kembali ke dalam situs, Fifield dan Milburn melihat makhluk aneh seperti ular muncul dari genangan cairan hitam yang bocor dari silinder. Ketika Milburn mencoba untuk memeriksa makhluk itu, dengan cepat makhluk itu meraih tangannya dan melingkarkan tubuhnya di lengannya, mematahkan tangan Milburn dalam hitungan detik. Ketika Fifield mencoba untuk memotongnya, cairan korosif (darah asam kuning) dari salah satu makhluk melelehkan helm Fifield, membuatnya terkena cairan gelap dan helmnya bocor. Makhluk itu kemudian masuk ke dalam jasnya dan memaksa masuk ke tenggorokannya.
Keesokan paginya setelah badai reda, kru Prometheus kembali ke situs dan menemukan mayat Milburn. David menemukan sebuah ruangan berisi Insinyur hidup dalam keadaan statis dan peta bintang holografik yang menyoroti beberapa sistem planet yang jauh. Dia menyaksikan hologram para Insinyur mengaktifkan sistem navigasi. Salah satu planet yang akhirnya muncul adalah Bumi. Tiba-tiba sistem mati, meninggalkan hologram Bumi. David menemukan Insinyur tunggal di pod stasis terdekat dan dapat mendengar detak jantungnya.
Infeksi Holloway dengan cepat merusak tubuhnya, dan dia dilarikan kembali ke kapal. Saat ia tampak memburuk, Vickers menolak untuk membiarkan dia naik, dengan alasan protokol karantina. Ketika dia mendekati Vickers, memohon padanya untuk membunuhnya, dia membakarnya sampai mati dengan penyembur api.
Pemindaian medis mengungkapkan bahwa Shaw, meskipun mandul, sedang hamil. Dia mengambil salib yang diberikan ayahnya, mengatakan bahwa itu bisa terkontaminasi. Dia melarikan diri dan menggunakan pod operasi medis otomatis di tempat Vickers untuk mengeluarkan makhluk mirip cephalopoda yang mengerikan dari perutnya saat dia masih sadar. Weyland ditemukan dalam keadaan statis di atas kapal, dan terungkap bahwa Vickers adalah putrinya. Weyland menjelaskan kepada Shaw bahwa dia bermaksud meminta Insinyur untuk membantunya menghindari kematiannya yang akan datang.
Sebuah makhluk bermutasi ditemukan di luar dan menyerang dan membunuh beberapa anggota awak sebelum bunuh diri. Janek berteori bahwa planet tempat mereka berada digunakan oleh para Engineer sebagai pangkalan militer sampai mereka kehilangan kendali atas senjata biologis mereka, yaitu silinder dan cairan hitam yang dikandungnya. Awak yang tersisa kembali ke situs dan membangunkan Insinyur, yang menempati apa yang ditemukan sebagai kapal luar angkasa (desain yang sama dengan kapal luar angkasa alien terlantar yang terlihat di Alien (1979)).
David berbicara bahasa asing kepada Insinyur, menanyakan mengapa mereka menciptakan manusia dan memintanya untuk memperpanjang hidup penciptanya sendiri, Tuan Weyland. Insinyur merespons dengan merobek kepalanya dan membunuh Weyland dan Ford. Shaw lolos dari kapal alien saat diaktifkan oleh Engineer.
David yang masih aktif menyarankan Insinyur akan melepaskan ampul cairan hitam di Bumi, sehingga membunuh setiap makhluk hidup di planet ini. Vickers memerintahkan Janek untuk kembali ke Bumi, tetapi Shaw meyakinkannya untuk menghentikan kapal Insinyur. Janek dan dua awaknya yang masih hidup lepas landas dan menabrakkan Prometheus ke kapal Insinyur sementara Vickers melarikan diri dengan pod pelarian. Kapal Insinyur yang cacat menabrak bukit, jatuh ke Vickers, menghancurkannya. Shaw nyaris tidak lolos dari kehancuran dirinya sendiri.
Shaw pergi ke pod pelarian untuk mengambil persediaan dan menemukan bahwa keturunan aliennya yang diaborsi tetapi masih hidup telah tumbuh menjadi ukuran raksasa. Insinyur selamat dari kecelakaan itu, memasuki pod pelarian dan menyerang Shaw, yang melepaskan makhluk tentakel itu. Ia menundukkan Insinyur dengan menyodorkan ovipositor ke tenggorokannya. Shaw percaya dia terdampar di planet ini sampai David menghubunginya dan mengatakan kepadanya bahwa ada lebih banyak kapal Insinyur di tempat lain di planet ini. Dia memulihkan sisa-sisa David dari kapal asing, mengambil kembali salib yang diambil David darinya, dan bersama-sama mereka melakukan perjalanan dan mengaktifkan kapal Insinyur lain. Shaw dan sisa-sisa android David kemudian berangkat untuk melakukan perjalanan ke homeworld Engineers, Paradise, dalam upaya untuk memahami mengapa mereka menciptakan umat manusia dan mengapa mereka kemudian berusaha untuk menghancurkannya.
